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技術(shù)文章

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技術(shù)文章

普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 對比分析

技術(shù)文章

 提起 PCR,在生物及其相關(guān)行業(yè)內(nèi)可謂如雷貫耳,**,其影響之深,應(yīng)用之廣可見一斑。
    1985 年,美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),實現(xiàn)了在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制。然而,采用 E-coli DNA 聚合酶進(jìn)行 PCR,由于該酶不耐熱,使這一過程耗時,費力,且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應(yīng)用使得 PCR 能率的進(jìn)行,隨后 PE-Cetus 公司推出了臺 PCR 自動化熱循環(huán)儀,從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。
    根據(jù) PCR 的發(fā)展進(jìn)程,本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數(shù)字 PCR 這三代 PCR 進(jìn)行分析,期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。

普通 PCR

基本原理
    PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種體外 DNA 擴增技術(shù),是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下,依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng),將待擴增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán),使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加,從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。

PCR 反應(yīng)體系舉例

10×擴增緩沖液      

10µl 

4 種 dNTP 混合物   

各 100~250μmol/L

引物                   

各 5~20μmol/L

模板 DNA                 

0.1~2µg

Taq DNA 聚合酶   

5~10U

Mg2+                  

1~3mmol/L  

加雙或三蒸水至    

100µl

儀器與耗材

    基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設(shè)備,能在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達(dá)到熱循環(huán)的目的,各有其優(yōu)缺點,在此不再贅述。

結(jié)果檢測

    PCR 反應(yīng)擴增出很高的拷貝數(shù),下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高,引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判,但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。

應(yīng)用

    PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制,大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的 DNA,就能用 PCR 加以放大,進(jìn)行比對。這也是「微量證據(jù)」的威力之所在。


實時熒光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) 

基本原理

    qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團,隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行,擴增產(chǎn)物不斷積累,導(dǎo)致熒光信號不斷積累, 從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進(jìn)程。
    根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出, 模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系,模板起始拷貝數(shù)越多,熒光信號達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少,即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系, 只要對熒光信號進(jìn)行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值,即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
    Ct 值指 PCR 擴增過程中,擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進(jìn)行 96 次擴增,終點處產(chǎn)物量不恒定,但 Ct 值卻重現(xiàn)性。


    模板 DNA 量越多,熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少,即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系,通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品 Ct 值,就可以計算出樣品中所含的模板量。

 

 

目前常用熒光標(biāo)記方法

方法

優(yōu)點

缺點

應(yīng)用范圍

SYBR Green I

適用性廣

靈敏

方便

便宜

引物要求高

易出現(xiàn)非特異條帶

科研中對各種目的基因定量分析,基因表達(dá)量的研究,轉(zhuǎn)基因重組動植物研究

Taqman

特異性高

重復(fù)性好

價格高

只適合特定目標(biāo)

病原體檢測,疾病耐藥基因研究,藥物療效考核,遺傳疾病診斷

分子信標(biāo)

高特異性

熒光背景低

只適合特定目標(biāo)

設(shè)計困難

價格高

特定基因分析,SNP分析

 

熒光定量 PCR 反應(yīng)體系舉例

試劑

含量

2xGoTaq Master Mix

5µl

無核酸酶水

3.5µl

上游引物

0.25µl

下游引物

0.25µl

基因組 DNA

1µl(約20ng)梯度稀釋

共 10µl

 

儀器與耗材

    在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng),就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同,只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記,使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出,把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道,雙通道,和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候,選用單通道,有多熒光標(biāo)記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物,因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量,需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測,生物醫(yī)藥研發(fā),食品行業(yè),科研院校等機構(gòu)。

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